Обработка и подбор на сперматозоиди

Специфични методи за обработка и подбор на сперматозоиди

Естествените системи, които природата е изградила, са идеален пример за разрешаването на някои от предизвикателните биологични проблеми при асистираната репродукция. Това дава възможност на специалистите, занимаващи се с репродуктивна медицина, да разберат и развият иновационни технологии за подбор на качествени сперматозоиди. Както за инсеминация, така и за всяка ин витро процедура, сперматозоидите се обработват и изолират по подходящи (щадящи) начини чрез разнообразни техники и методи.

Сред всичките налични терапевтични подходи в асистираната репродукция инжектирането на предварително избран сперматозоид в зряла яйцеклетка е най-ефективният метод за оплождане и преодоляване на тежък мъжки фактор. Подборът на сперматозоиди с добра подвижност е ключова стъпка и част от пъзела към успеха за постигане на бременност при един ин витро цикъл. Нашият екип използва високо ефикасни техники за подбор на сперматозоиди:

1. Вътрецитоплазмено инжектиране на морфологично подбран сперматозоид в яйцеклетка (Intracytoplasmic Morphologically Selected Sperm Injection, IМSI) – морфологичният подбор на сперматозоиди в момента е най-широко използваният метод в комбинация с ICSI оплождането на яйцеклетки. Основава се на концепцията, че сперматозоиди с по-малко видими дефекти е по-вероятно да носят нормален хормозомен набор и следователно са по-подходящи за инжектиране, а оплодените яйцеклетки и развилите се от тях ембриони са с по-добри шансове за успешно имплантиране и по-малка вероятност от спонтанен аборт. IMSI процедурата се извършва непосредствено преди същинското ICSI оплождане. При тази техника се използва специално микроскопско оборудване с голямо оптично увеличение (над 16000 пъти), позволяващо много прецизен анализ на морфологичните характеристики на сперматозоидите, като се oтĸpиват и преодоляват дeфeĸти в тях, ĸoитo ocтaвaт cĸpити пpи cтaндapтнoто миĸpocĸoпcĸo yвeличeниe. Благодарение на метода се подбират жизнеспособни и качествени сперматозоиди. Приложението на IMSI е препоръчително при пациенти с висок процент сперматозоиди с лоша морфология или ДНК фрагментация; при неуспешно оплождане след ICSI; при ембриони с лоша морфология от предходни процедури; при неуспешна бременност без видими причини.

2. Вътрецитоплазмено инжектиране на физиологично подбран сперматозоид в яйцеклетка (Physiological Intracytoplasmic Sperm Injection, PICSI) – техниката представлява допълнителна физиологична селекция на сперматозоиди преди ICSI оплождане, основаваща се на молекулно ниво, което е невидимо в детайли дори при микроскопско наблюдение. Методът използва поведението и свойството на сперматозоидите в естествени условия да се прикрепят към хиалуронан. Хиалуронанът е познат още като хиалуронова киселина. Зрелите, жизнеспособни и перспективни сперматозоиди се свързват с хиалуроновата киселина, която е основен компонент в обвивката на яйцеклетката и един от тях впоследствие успява да осъществи оплождането. Сперматозоидите, способни да се свържат към хиалуронан, имат по-малка вероятност за носителство на хромозомни аномалии и по-голяма структурна цялост на ДНК.

При PICSI методa се използва петри, покрито с капки хиалуронан, към които се добавят предварително изолирани подвижни сператозоиди. Физиологично зрелите и активни сперматозоиди се свързват с хиалуронана, като това позволява на ембриолога да разграничи най-ефективните гамети с висока оплодителна способност и да ги използва при последващото ICSI оплождане. PICSI се предлага в случаи с нисък процент на оплождане след ICSI, нарушения в развитието на ембриони при предишни ин витро цикли, лоши показатели на спермограмата и висока степен на ДНК фрагментация в сперматозоидите, история от спонтанни аборти, напреднала възраст на майката (над 35 години).

3. Цетрофугиране на еякулат. Центрофугирането е един от основните методи за обработката на семенна течност и изолиране на сперматозоиди от нея. Извършва се в стерилни лабораторни условия. Индикации за прилагането на техниката са последващи процедури като интраутеринна (вътрематочна) инсеминация, класическо и/или ICSI оплождане. Центрофугиране се прилага и в случаи на ретроградна еякулация, замразяване (криосъхранение) на сперматозоиди и азооспермия (липса на сперматозоиди). При азооспермия целта на центрофугирането е да се намали първоначалният обем на еякулата и в случай на налични сперматозоиди, те да се уталожат в утайка на дъното на епруветката, като впоследствие, ако се открият, могат да бъдат използвани за оплождане чрез ICSI.

4. Swim-up техника. С помощта на тази процедура сперматозоидите могат да бъдат селектирани според тяхната подвижност в семенната течност и културалната среда за изолиране. Подобна техника е известна като swim-up метод. Препоръчително е еякулатът да не бъде центрофугиран преди да се приложи swim-up, защото това може да доведе до обездвижване на сперматозоидите и увреждане на клетъчните им мембрани. Методът е предпочитан за разделяне на подвижни от неподвижни сперматозоиди. Директната swim-up техника може да се извърши чрез наслояване на хранителна среда върху втечнената семенна течност или чрез наслояване на втечнена сперма под хранителна среда. Като резултат подвижните сперматозоиди преминават в хранителната среда. Тази процедура дава по-нисък добив на сперматозоиди, отколкото обработването и изолирането им с други методи, но подбира по-жизнените, което е от значение за класическо и/или ICSI оплождане.

5. Центрофугиране в плътностен градиент. Тази техника представлява сепариране (разделяне) и концентриране на най-подвижната фракция сперматозоиди и същевременно редуциране на неподвижните сперматозоиди, премахване на клетъчния детрит, клетки от сперматогенезата и клетки на имунната система (левкоцити, лимфоцити, еритроцити) от еякулата. При този метод се използват градиентни разтвори с различна концентрация (например, 40% и 80%), които разделят различните клетки спрямо тяхната плътност. Активно подвижните сперматозоиди се отлагат като утайка, а неподвижните сперматозоиди и другите клетки се задържат на границите между различните концентрации на градиентния разтвор. Процедурата се използва за обработка и подготвяне на сперматозоиди за класическо и/или ICSI оплождане.

6. Swim-up метод след центрофугиране през плътностен градиент. Тази техника представлява съчетание на двата основни метода за изолиране на сперматозоиди с добра подвижност – swim-up метод и центрофугиране в плътностен градиент. Еякулатът първоначално се центрофугира в плътностен градиент. След това утайката внимателно се наслоява с подходяща хранителна среда за сперматозоиди. За класическо ин витро или ICSI оплождане се използва средата с изплувалите в нея сперматозоиди.

7. Магнитно клетъчно сепариране или отстраняване на сперматозоиди с високи нива на ДНК фрагментация (Magnetic-Activated Cell Sorting, MACS). Представлява метод за селективно отстраняване на сперматозоиди с фрагментирана (увредена) ДНК. Премахват се и сперматозоидите, насочени към апоптоза (програмирана клетъчна смърт), от тези с интактна (цялостна, неразрушена) плазмена мембрана. Процедурата се базира на използването на магнитни микросфери, покрити с белтъка анексин V (клетъчен протеин), който има висок афинитет на свързване към молекули фосфатидилсерин (фосфолипид), появил се на външната повърхност на клетъчната мембрана на апоптичните сперматозоиди. Тази техника позволява магнитно изолиране на негодните клетки. Процедурата включва пропускане на сперматозоидите през разделителна колона, намираща се в магнитно поле, като некачествените се задържат селективно. Подходящите за оплождане сперматозоиди, без ДНК фрагментация и висок оплодителен потенциал, преминават през колоната и се събират за по-нататъшна употреба при различните асистирани репродуктивни техники (например за ICSI оплождане, инсеминация или криосъхранение). Препоръчително е MACS методът да се използва в случаите на силно занижени спермални показатели, повишена степен на ДНК фрагментация (DFI>30%) в сперматозоидите, неуспешно развитие на ембриони от предишни опити, ембриони с лошо качество, повтарящи се имплатационни неуспехи или спонтанни аборти.

8. Микрофлуидна система (микрочип) за изолиране на човешки сперматозоиди – сред всичките налични терапевтични подходи в асистираната репродукция инжектирането на предварително избран сперматозоид в зряла яйцеклетка (ICSI оплождане) е най-ефективният метод за оплождане и преодоляване на тежък мъжки фактор. Подборът на сперматозоиди с добра подвижност е ключова стъпка и част от пъзела към успеха за постигане на бременност при един ин витро цикъл. Естествените системи, които природата е изградила, са идеален пример специалистите, занимаващи се с репродуктивна медицина да разберат и развият възможността за разрешаването на някои от предизвикателните биологични проблеми. В ин виво условия сперматозоидите преминават през мукозни микроканали, докато намерят правилния път до яйцеклетката. Съществува начин във външни (ин витро) условия да се наподоби микрофлуидната среда по пътя на сперматозоидите от цервикалния канал, водещ до вътрематочното пространство, и да се осъществи последващо оплождане.

През последните няколко години микрофлуидните системи се развиват все по-бързо и намират все по-голямо приложение в асистираните репродуктивни технологии. Подобни системи са вариант за изолиране на сперматозоиди, дори за оплождане и култивиране на ембриони. Преобладава разработването и доусъвършенстването на тази техника като метод за селекция на сперматозоиди в лабораторни условия. Селекцията на сперматозоиди за ICSI или класическо ин витро оплождане (IVF) се основава предимно на тяхната концентрация, подвижност и морфология.

Настоящите стандартни процедури за изолиране на сперматозоиди – центрофугиране, swim-up метод, центрофугиране в плътностен градиент, не са толкова ефикасни и крият някои недостатъци. Центрофугирането само по себе си може да увреди гаметите поради въздействие на центробежни сили или концентриране на по-високи количества свободни кислородни радикали. Тази техника е неподходяща за ефективно отделяне на подвижни от неподвижни сперматозоиди. В някои от случаите swim-up методът изисква повече време. Неефикасен е за случаите, при които преобладават сперматозоиди с много ниска концентрация и слаба подвижност. Центрофугирането в плътностен градиент е селективен подход. Недостатък е, че предизвиква увеличаване нивата на излишна ДНК фрагментация при сперматозоидите.

Съществуват изследвания, доказващи по-добро и надеждно изолиране на сперматозоиди при използване на микрофлуидни системи (микрочипове) в сравнение с конвенционалните методики, описани по-горе. Микрочиповете предоставят изолиране на здрави бързо подвижни сперматозоиди с нормална морфология и ниски нива на ДНК фрагментация за кратко време (около 10-30 мин.). Способстват за отделяне на функционално зрелите сперматозоиди (с висок мембранен интегритет) от незрелите клетки, създавайки ламинарен поток на флуидите чрез хидростатично налягане и биохимични градиенти по протежение на микроканалите, подобни на тези, открити в яйчниковата микросреда. Счита се, че микроканалите мимикрират естествените механизми на селекция, които протичат във вагината и по-горните участъци. Осигуряват геометрично ограничена микросреда, наподобявайки малки каналчета, формирани от мукуса, през които сперматозоидите преминават. При използване на микрочипове не е необходима предварителна обработка на спермалната проба. Единствено трябва да се съобрази да не се допусне запушване на микроканалите със силно концентрирана проба или да се използва проба с висок вискозитет. Друго предимство на микрофлуидните системи е, че сперматозоидите могат директно да се наблюдават под светлинен микроскоп, докато се осъществява тяхното изолиране.

9. Обработка и изолиране на сперматозоиди при състояние на ретроградна еакулация – представлява процедура на разделяне на сперматозоидите от урината за по-нататъшно прилагане техниките на асистирана репродукция или замразяване с цел криосъхранение. Ретроградната еякулация се получава, когато семенната течност, която по правило нормално достига уретрата и се отделя през нея, се пренасочва обратно към пикочния мехур. Това се случва, когато сфинктерът около шийката на пикочния мехур не функционира правилно, т. е. частично или изцяло е отворен и не може да блокира семенната течност, за да излезе напълно през уретрата. Ретроградната еякулация клинично може да протече със силно намален обем еякулат или да доведе до аспермия (пълна липса на еякулат). От попадналата в пикочния мехур постеякулатна семенна течност могат да се селектират сперматозоиди при отделяне на мътна урина след оргазъм. Ако състоянието не може да се излекува фармакологично, се преминава към изолиране на сперматозоидите от урината. Урината се алкализира, повишава се рН-то й, като пациентите предварително приемат алкален разтвор, което увеличава шанса да се запази подвижността на отделените сперматозоиди.

10. Обработка и изолиране на сперматозоиди след епидидимална и тестикуларна аспирация/биопсия (PESA, MESA, TESA и TESE). Тестикуларната (TESA, TESE) и епидидималната аспирация/биопсия (PESA, MESA) се използват за извличане на сперматозоиди директно от тестиса или надсеменника. Сперматозоидите се произвеждат в тестисите и доузряват в епидидимисите, но понякога е възможно да не присъстват в еякулата. Взетите сперматозоиди от органи на репродуктивния тракт не се считат за напълно зрели. Генетично сперматозоидите могат да са нормални, но подвижността и потенциалът им за откриване и проникване в яйцеклетката са намалени, тъй като тези свойства се придобиват след напускане на тестисите и преди еякулацията. Ето защо са необходими асистирани репродуктивни техники, за да може тези сперматозоиди да доведат до успешно оплождане и реализиране на бременност. Сперматозоидите, получени чрез аспирация/биопсия на тестиса или надсеменника, почти винаги се използват за ICSI оплождане. След като ICSI процедурата е завършена, останалите подвижни сперматозоиди могат да бъдат замразени и криосъхранени за използване в бъдещи ICSI цикли. Съществуват няколко варианта на микрохирургична аспирация/биопсия:

• PESA (подкожно аспириране на сперматозоиди от надсеменника (епидидимиса)) представлява проникване с игла през кожната торбичка (скротум), обвиваща тестисите, за да се извадят сперматозоиди от надсеменника, където обикновено те се съхраняват след производството им в тестисите.
• Вариант на PESA е техниката MESA (микрохирургична аспирация на епидидимални сперматозоиди), при която се извършва дисекция (разрез) на епидидимиса.
• TESA (аспирация на сперматозоиди от тестисите) включва проникване с малка игла, прикрепена към спринцовка през скротума, за да се съберат сперматозоиди от тестиса.
• TESE (микрохирургично извличане на сперматозоиди от тестисите) представлява процес на хирургично изрязване под локална или пълна анестезия на малко парче от тъканта на тестиса, съдържаща жизнеспособни сперматозоиди. Процесът екстракция на сперматозоиди от епидидимиса или тестиса се препоръчва на мъже със заключение азооспермия, причинена от първична тестикуларна недостатъчност, вродена липса на семепроводи, запушване на семепроводите (обструктивна азооспермия) или нереконструирана вазектомия. Благодарениe на техниките аспирация/биопсия на надсеменник/тестис дори при ограничен брой нормални сперматозоиди може да се осъществи ICSI оплождане, като по този начин се преодолява нуждата от използване на донорски сперматозоиди.